4. Microscopia de las setas: 4.7 el microscopio

Un Microscopio es un instrumento que permite obtener una imagen aumentada de objetos o detalles muy pequeños.

En Micología se utiliza para determinar los caracteres microscópicos de las setas y hongos.

Fundamentalmente se usa el Microscopio óptico ya que es fácil de manejar, permite visualizar todos los caracteres microscópicos más importantes de las setas y además está al alcance de los estudiosos de la Micología por ser fácil de transportar y tener diferentes precios asequibles a todos los bolsillos.

EL MICROSCOPIO ÓPTICO

Los principales componentes básicos que constituyen el microscopio óptico son:

• Revólver, pieza sobre la que están fijados los objetivos y que permite permutarlos de acuerdo a las necesidades de aumentos.
• Objetivos, son las distintas lentes de acuerdo a su poder de magnificación. Normalmente se instalan sobre el microscopio los siguientes aumentos:
• Normal 4X (en seco): 10 x 4 = 40X (aumentos totales)
• Medio 10X (en seco): 10 x 10 = 100X
• Alto 40X (en seco): 10 x 40 = 400X
• 100X (Aceite de inmersión): 10 x 100 = 1000X

Nota. En un microscopio lo que importa es la resolución, es decir la imagen con los detalles visibles al máximo y no la magnificación o los aumentos, ya que se puede ver un objeto enormemente aumentado y sin embargo verse borroso o sin detalles.

Por otro lado, conviene recordar lo que se define como contraste, muy aplicado en microscopía, que es la diferencia de brillo de los distintos detalles del objeto. El ajuste de esta característica permite ver muchas veces adecuadamente la propia preparación microscópica.

• Portamuestras, pequeña placa de vidrio transparente sobre la que se ha depositado la preparación microscópica, provista de una fina película de vidrio denominada cubreobjetos que actúa de protección y que se sitúa sujeta sobre la platina. El haz de luz la atraviesa para que la preparación pueda ser vista en el ocular.
• Platina, actúa de base movible para desplazar la preparación microscópica y centrarla en el ocular. A su vez mediante un accesorio fija el portamuestras de cristal.
• Diafragma, controla el diámetro de intensidad de luz que ilumina la preparación del portamuestras y a su vez controla la profundidad de campo.
• Condensador ABBE, permite iluminar y controlar correctamente el brillo de la preparación además de evitar que la luz se disperse.
• Iluminación, este dispositivo enfoca y canaliza la luz que se va a transmitir hasta el ocular y permite colocar filtros para usos especiales (azules, verdes o de luz polarizada) que mejoran la visión de la preparación.
• Desplazamiento x-y, pieza que permite centrar sobre el haz de luz la preparación microscópica mediante movimientos en ambos sentidos horizontal y vertical.
• Enfoque, son dos dispositivos, grueso y fino, que permiten regular el enfoque de la visión de la preparación mediante acercamiento de las lentes por desplazamiento hasta su perfecto ajuste de visión.

 

PREPARACIÓN DEL MICROSCOPIO PASO A PASO

 

Encendido del microscopio óptico

Vamos a comenzar por encender el microscopio, cuidando de que la bombilla esté baja de iluminación para evitar el desgaste innecesario de la misma.

Adaptación de los oculares a tu vista

Los oculares se ajustan de acuerdo a tu visión mediante giro de rueda en un sentido de aproximación u alejamiento. Seleccionar inicialmente el objetivo de menor aumento x4 o x10 para enfocar el objeto, esta forma es la más fácil para localizar y enfocar el objeto situado en el portaobjetos. Ambos oculares pueden enfocarse independientemente.

Normalmente el ocular derecho suele disponer de una lente provista de escala micrométrica para tomar medidas de las formas microscópicas y también puede ser extraída para adaptar una cámara de fotografía o de video donde reproducir las imágenes.

Enfoque del condensador (1)

Existe un disco regulable en la parte superior del condensador, asegúrate que está en la posición 0 de brillo.

Muchas veces no vas a necesitar establecer contraste de brillo, sin embargo a veces va a permitir la visión con más detalles, juega con ello hasta conseguir el efecto deseado.

El cuerpo inferior controla la apertura del diafragma y permite pasar más o menos la luz con el fin de iluminar adecuadamente el objeto.

Enfoque del condensador (2)

Abrir el iris del diafragma situado en la plataforma del condensador (A), una pequeña palanca situada en el centro del condensador.

Enfoque del condensador (3)

Mirar a través de los oculares y lentamente ajusta el condensador hasta conseguir una visión completamente clara en el diafragma (apariencia poligonal con bastante detalle).

Enfoque del condensador (4)

Si el círculo de luz está descentrado, se puede centrar mediante los tornillos (A).

Detalle donde se pueden apreciar, el revólver con los objetivos y el portamuestras sujeto sobre la platina con la preparación microscópica.

 

Como usar el aceite de inmersión con la lente de x 100 aumentos

El objetivo x100 se usa solo con aceite de inmersión. Para enfocar la muestra necesita tener una gota de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos.

1. Para usar esta lente es necesario primero enfocar con el objetivo x 40.
2. A continuación cerrar el diafragma para que la luz sea lo más intensa posible sobre la muestra.
3. Girar el revólver entre los objetivos x 40 y x 100, colocar una gota de aceite sobre el cubreobjetos en línea con el haz de luz.
4. Girar y poner el objetivo x 100. El aceite deberá de actuar como separador de la lente y el cubre objetos. A partir de este momento solo enfocar con el componente fino de ajuste.

Atención: una vez puesto el aceite de inmersión no se puede cambiar el objetivo y solo se moverá para su limpieza con papeles especiales de limpieza de lentes ópticas.

Cuando se pretenden observar las preparaciones microscópicas, la mejor forma es verlas sobre medios acuosos que no interfieren sobre los componentes microscópicos. Sin embargo, muchas veces no son posibles estas observaciones si no están coloreadas, normalmente por la acción de reactivos químicos.

La variación de los colores de los componentes microscópicos al añadir reactivos o colorantes son características fundamentales para poder clasificar microscópicamente las setas y los hongos. Al igual que ocurre con los caracteres macroscópicos donde se establecen reacciones que pueden colorear las diferentes partes externas de una seta, también se dan reacciones microquímicas que permiten diagnosticar y clasificar con todo detalle una especie de seta concreta.

 

TIPOS DE MICROSCOPIOS

La función de un microscopio es obtener una imagen aumentada y conseguir detalles de los objetos microscópicos que se pretender ver. Dependiendo de la fuente energética que utilizan, se pueden distinguir dos tipos de microscopios:

• MICROSCOPIOS ÓPTICOS, utilizan la luz como fuente energética
.
• MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS, cuando emplean un haz de electrones.

La principal diferencia entre ellos, estriba en la mayor potencia que tienen los microscopio electrónicos que al utilizar electrones para iluminar un objeto, lo iluminan con mucha mayor intensidad de luz y por tanto pueden mostrar estructuras con más detalles y mucho más pequeñas.

En ambos casos los microscopios permiten la observación gracias a su capacidad de aumento (la cantidad de veces que se incrementa el tamaño de la imagen del objeto observado) y de resolución (capacidad del microscopio que permite distinguir como de separadas están dos estructuras que se encuentran muy próximas). El que se vea enormemente aumentado el objeto no significa que se vea nítido o con detalles.

MICROSCOPIOS ÓPTICOS

El microscopio más simple es una lupa, donde el objeto que queremos observar se coloca a una distancia del foco de visión y la lente, de manera que moviendo la misma se consigue que su imagen se haga nítida. Con ello se permite ver solamente caracteres superficiales y normalmente el número de aumentos es pequeño pero suficiente como para ver detalles que a simple vista no son posibles de detectar.

Con mayor capacidad de aumento existen diferentes tipos de microscopios cada uno de ellos con distintas características que hacen posible la visión aumentada de los objetos microscópicos.

• Microscopio de campo claro, permite ver imágenes oscuras al ser puestas frente a un haz de luz. Se pueden ver estructuras internas de la muestra aunque es necesario que la muestra esté en forma de una fina capa para que pueda ser atravesada por la luz.
• Microscopio de campo oscuro, en los que sobre un fondo oscuro pueden verse los objetos intensamente iluminados. Requiere condensadores especiales que mandan la luz de manera especial de tal forma que reflejan las zonas que desean ser vistas a través del objetivo.
• Microscopio de contraste de fases, producen variaciones de luz de manera que hacen que sean visibles distintas partes de una muestra. Incorporan un dispositivo especial, situado dentro del condensador, que produce diferencias de longitud de onda en los distintos rayos y debido a este principio establece formas características de visión de la muestra.
• Microscopio de luz ultravioleta, por medio de una lámpara especial emite luz a una determinada longitud de onda comprendida entre 180 – 400 nm, de tal forma que proporciona aspectos diferenciadores señalados al visualizar la muestra.
• Microscopio de fluorescencia, que se basan en el principio de fluorescencia que tiene determinadas sustancias que al ser iluminadas por una radiación determinada experimentan una concentración de luz de manera especial denominada fluorescencia que permite ver estas zonas con una mayor nitidez e intensidad de luz.

 

MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS

La luz es un haz de electrones, estos electrones son propagados a través de un tubo e inciden sobre el objeto y posteriormente son refractados y recogidos en una pantalla. Debido a su alto poder de resolución permiten ver tamaños, formas, estructura y morfología de elementos microscópicos con más detalle que en los microscopios ópticos.

Fundamentalmente existen dos tipos:

• Microscopio electrónico de barrido (SEM), se utiliza para la observación superficial de objetos o estructuras microscópicas sin necesidad de realizar cortes en las mismas. De esta forma es posible analizar toda la superficie de la imagen a analizar y su funcionamiento se basa en recorrer la muestra con un haz muy concentrado de electrones como consecuencia del barrido electrónico se genera una imagen con apariencia tridimensional, que permite estimar parámetros tales como tamaño y forma, que no pueden ser obtenidas por TEM. Sin embargo, tiene menor capacidad de aumento ya que sólo puede aumentar unas 100000 veces y también tiene una resolución 1000 veces menor que el TEM, además de que no permite ver partes internas del objeto.
• Microscopio electrónico de transmisión (TEM), utiliza un haz de electrones que se dirige hacia el objeto que se desea aumentar; una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Fundamentalmente permite ver secciones o cortes de las muestras a analizar con espesores comprendidos entre 50- 200 nanómetros, aunque previamente estas han de cortarse en capas muy finas mediante un micrótomo.

Distintas fotos de estructuras microscópicas y esporas de setas obtenidas por Microscopía Electrónica de Barrido (SEM)

HISTORIA DEL MICROSCOPIO

• El origen del microscopio se remonta 1200 años atrás, hasta las lentes correctivas de Abbas Ibn Firnas.
• El libro sobre óptica de Ibn al-Haytham dio origen a la lupa
• El microscopio en sí fue inventado hacia los años 1610, por Galileo, según los italianos, o por Zacharias Janssen, en opinión de los holandeses.

• Las primeras publicaciones importantes en el campo de la microscopía aparecen en 1660 y 1665, cuando Marcello Malpighi prueba la teoría de William Harvey sobre la circulación sanguínea al observar al microscopio los capilares sanguíneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia.
• En 1665 Hooke observó con un microscopio la primera observación de células muertas.
• Malpighi, anatomista y biólogo italiano, observó unos años más tarde, células vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio.

• Anton Van Leeuwenhoek, comerciante holandés, a mediados del siglo XVII, utiliza microscopios simples de fabricación propia y describe por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glóbulos rojos.
• Durante el siglo XVIII continuó el progreso y se lograron objetivos acromáticos por asociación de vidrios flint y crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta época son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler.

• Amici, inventa en 1850 el primer sistema de lentes para un microscopio acromático y más tarde desarrolla el objetivo de inmersión de agua.
• Duboscq et Nachet desarrollan en 1863 el condensador de fondo negro.
• En el siglo XIX, se lanzan al mercado objetivos acromáticos excelentes al descubrirse que la dispersión y la refracción se podían modificar con combinaciones adecuadas de dos o más medios ópticos,
• Ernst Abbe en 1877, publica su teoría del microscopio y por encargo de Carl Zeiss, mejoró la microscopía de inmersión sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000.

• Köhler en 1893 mejora sistemas del microscopio óptico y desarrolla con Rohr el microscopio de luz ultravioleta en 1904.
• Siedentopf, fabrica en 1904 el primer microscopio de fluorescencia.
• A principios de los años 1930 se había alcanzado el límite teórico para los microscopios ópticos, no consiguiendo éstos aumentos superiores a x 500 o x 1000 que no permitían observar los detalles de estructuras celulares. Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania en 1931 desarrollan el primer tipo de microscopio electrónico de transmisión (TEM) que utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo aumentos de x 100000.
• Zernicke desarrolla el microscopio de contraste de fase en 1935.
• En 1942 se desarrolla el microscopio electrónico de barrido (SEM).
• En 1952, Nomarski inventa el microscopio interferencial.

 

Marcelo Aroca Hervás 2009